今天pink来给大家分享一些关于多聚甲醛固定12孔板细胞多聚甲醛固定怎么操作方面的知识吧，希望大家会喜欢哦
1、在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，使用PBS轻洗细胞2×3min，做固定（凋亡的TUNEL染色等可以不清洗）。
2、固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。如暂时不能立即做组化检测，使用含0.4%多聚甲醛的PBSPH7.4浸泡细胞（免疫组化检测完成前不要让细胞变干，否则细胞收缩形态不好）。
3、除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3min。
4、通透：0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）。
5、除去TritonX-100，使用PBS轻洗细胞3×3min。
6、内源性过氧唤没化物酶处理：3%H2O2孵育15min（选做，必做二抗连HRP，其他的如做免疫荧光染色不用做）。
7、除去H2O2，使用PBS轻洗细胞3×3min。
8、封闭：用10%的与二抗同源的血清(PBS配制)封闭半小时。封闭结束后不要洗，直接上一抗。
9、抗：滴加足够量适宜浓度的一抗，4℃孵育隐陪过夜（或37℃，60min）；若有两种一抗（要是不同种属的）则同时孵育，两种二抗亦同时孵育（二抗同时使用时最好是同一种属）。
10、10、除去一抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。
11、二抗：滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，30min（从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行）。
12、除去二抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。
13、二氨基联苯胺（DAB）底物显色：室温下避光孵育5至10分钟，或直至样本出现棕褐色（选作，二抗连得是酶的必做，显色时间严格控制，要避免显色过度引起假阳性；二抗连的是荧光素的不用做）。
14、除去显色工作液，使用PBS冲洗细胞3~4次。
15、复染核：0.5ug/mlDAPI（或200nMHoechst33342）避光孵育5min。
16、使用PBS轻洗细胞4×5min，洗去多余的DAPI。
17、取爬片时将注射器针头针尖向背面做个小钩，将爬片轻轻勾起，用小镊子取出和携纳。
18、用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。
19、保存细胞爬片，在培养皿底放一层面巾纸，放爬片，便于实验取片。在盖子上做标记，在-20℃可保存2-3个月。
多聚甲醛和戊二醛都是常用的固定剂，但它们的固定效果因应用启绝瞎环境和具体情况而异。
一般来说，多聚甲醛比戊二醛更常用，因为多聚甲醛的固定效果更好，对于固定细胞和组织具有更好的保护性。同时，多聚甲宏唤醛固定后的标本形态更好，能够更好地保留细胞和组织的形态结构。
但是，在某些特殊情况下，使用戊二醛可能会更合适，例如需要使用低浓度的固定剂时，或者需要进行特殊的免疫染色等实验时，戊二醛可悄空能更适合使用。
多聚甲醛之所如扒以能够起到很好的固定效果，和它的制作工艺、物理性质和化学性质是分不开的。多聚甲醛多制成多聚甲醛固定液来袭茄进行固定，多聚甲醛液的配方决定了拍橡察多聚甲醛的固定性，多聚甲醛液中含有pbs溶液，HCL，这些溶液和多聚甲醛按照一定的方法混合在一起就具有了个定作用。
细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长。主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片的准备
1盖玻片的选择：
爬片可用一般的盖玻片，也可用专用细胞爬片（价格比较昂贵）但是细胞贴壁牢固，拍出照片效果好；
2爬片的剪裁：
可根据自己的需要，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色剪裁成合适大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；
3爬片的使用前处理：
将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，答液第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可带举燃以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。
4多聚赖氨酸的使用：
很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。
细胞爬片的操作
1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2.加细胞前，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。(整个过程注意无菌操作)
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度接入培养板内即可。
4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。
细胞爬片的固定
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，有例外，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。
然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将蠢虚盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
多聚甲醛固定，确实是老生长谈，很多研究生在做实验时，可能很多师兄师姐都让他们用多聚甲醛固定，有些可能是为了长时间保存样本，希望集中起来染色，有些可能是染色后排不上队，想保持长时间质量稳定。于是就这么口口相传下来了。
预固定问题
做科研或临床时，可能很多FLOWER习惯性都会用4％多聚甲醛预先固定标本，可能出于三个目的：（1）为了灭活标本里面可能存在的微生物（细菌、病毒等），起到安全保障作用。（2）希望标本能够较长时间存放。（3）做胞内染色前的准备。但是，可能很多人忽视了一点，就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本，细胞表面有些位点在固定后构象发生改变，使得抗体无法结合产生假阴性，也可能由于固定作用，导致其它位点产生非特异性结合（假阳性）。
因此，知道哪些抗体染色前不能预固定，十分重要。幸好，我们自己不用做验证，在Biolegend公司网站[1]，贴心的技术人员已经帮我们做了一系列测试，下面两张表，一张是人类抗原，一张是小鼠抗原，可以看的出来，大多数不能派孝做预固定的抗体都是趋化因子受体，所以，大家在实验中千万要注意不要先固定后染色。
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表1、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（人类），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大
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表2、4％多聚甲醛预固定对各种抗体表面染色的影响（小鼠），打勾的为允许预固定，打叉的表示预固定影响很大
染色后固定问题
染色后的固定，就与抗原构象关系不大了，更多的是荧光素。以前4色以内的时候，用的荧光素都是非串联的，因此大多数影响不大，但随着各种新型串联染料的出现，多聚甲醛固定就成了问题了。
事实上，当你去搜索串联染色标记（如PE-cy7、APC-cy7等）的抗体时，会发现一些比较详细的描述里面会注明（以BD网站搜索APC-cy7各类抗体为例）：
Fixedcellsshouldbeanalyzedwithin4hoursoffixationinparaformaldehydeortransferredtoaparaformaldehyde-freebufferforovernightstorage.
意思就是用多聚甲醛固定过的样本，必须在4小时内检测，否则容易导致串联染料降解，若要长时间保存，还是需要洗涤后，转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。
需要注意的是，做GFP荧光检测的同学，也需要注意一下，多聚甲醛固定也会影响GFP，NewYorkMedicalCollege的PaulALucas认为是由于多聚甲醛固定后，并非使GFP荧光淬灭，而是使GFP蛋白构象发生改变，无法产生荧光[2]。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光，或剩余的未被改变构象的GFP发出的。
解决方案
1、如果检测的是前述表格中容易被多聚甲醛影响的分子，请尽量不要预固定，如需长期保存样本，可以考虑尘漏稿冻存单个核细胞。
2、如果检测的是前述表格中不会受多聚甲醛影响的分子，可用1％多聚甲醛预固定保存，但不能长时间使用，否则对细胞FSC、SSC和荧光强度影响大。此时可考虑使用流式中文网的FlowGuard®细胞保存液[3]，FlowGuard®是国内专利性原研产品，不含多聚甲醛，能缓释搜基出一种特殊的弱固定成份，FSC的变化较多聚甲醛轻微，对抗原强度保持更长久，样本:保存液＝6:1～10:1，21天内检测结果稳定性好。
3、如果希望在染色后保持24小时左右的荧光稳定，仍首选建议：避光、4度，我们曾经在10色（BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7）流式方案非正式测试时，曾经测过数例，在避光、4度保存24小时后，荧光强度几乎无变化，细胞分群良好。如果仍不放心，可考虑购买商品化的适用于串联染料的专用保存剂
本文到这结束，希望上面文章对大家有所帮助